本文刊载于《集成技术》年第4期

合成生物学国际形势与前沿技术分析专题（I）

刘陈立1,2*，董宇轩1,2，郭旋1

1中国科学院深圳先进技术研究院深圳合成生物学创新研究院中国科学院定量工程生物学重点实验室深圳

2中国科学院大学北京

摘要

Abstract

细菌疗法是肿瘤治疗领域的重要发展方向之一，合成生物学的日益发展为肿瘤细菌疗法提供更多样化、更有效安全的治疗策略。该文概述了细菌治疗肿瘤领域的临床优秀范例，详细介绍了目前的研究进展及面临的瓶颈问题，并围绕肿瘤细菌疗法深入探讨了合成生物学在推动活菌药物临床开发中的应用。此外，针对临床活菌药物的有效性和生物安全性问题，展望了合成生物学在临床药物开发中的重要作用和未来发展趋势。

1引言

回顾肿瘤细菌疗法走过的百年历程，从最早外科医生的偶然发现(患者感染病原菌后肿瘤生长得到抑制)[1]，到WilliamB.Coley医生开发细菌制剂Coley’sToxins用于肿瘤治疗[2]，再到近二十年研究者通过基因工程改造细菌来提高肿瘤治疗效果，细菌疗法在肿瘤治疗中一直扮演着重要角色。近年来，随着合成生物学的蓬勃发展，研究者也在思考如何进一步优化肿瘤细菌疗法，为肿瘤治疗提供更多样化、更有效安全的策略[3]。

肿瘤细菌疗法依赖自然界中细菌的毒力、自主运动能力以及对肿瘤的趋向性和侵袭能力等特征，使细菌具有调节肿瘤免疫微环境、诱导抗肿瘤免疫反应的能力[4]。目前研究者依据细菌生物生理功能的不同，为治疗肿瘤提供了不同的干预策略[5]。此外，细菌基因组简单，易于进行工程改造，这也进一步提高了细菌对环境感应、特异靶向和智能递送药物等能力[6]。上述特点赋予细菌为许多难治性、转移性癌症类型提供更好的解决方案的能力，加速了肿瘤细菌治疗药物在生物医药领域的研发进程和未来临床应用成功转化的可能性[7]。

本文从肿瘤细菌疗法面向临床试验的角度出发，归纳总结了梭状芽孢杆菌(Clostridiumsp.)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(Salmonellasp.)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等不同种属细菌在临床试验中的代表性研究进展和面临的瓶颈问题。重点介绍了合成生物学利用细菌作为模块化工程平台，设计微妙而复杂的基因线路，在提高细菌疗法有效性和改善临床生物安全性等方面的应用，从而弥补目前肿瘤细菌疗法在临床测试中的不足，助力细菌疗法突破瓶颈，推动临床试验进展。

2肿瘤细菌疗法在临床测试中的范例

2.1

抗生素梭状芽孢杆菌

梭状芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，是最大的原核生物属之一，由于芽孢形态呈圆形或卵圆形，使菌体膨大呈梭状，所以被称为梭状芽孢杆菌[8]。梭状芽孢杆菌是专性厌氧菌，因此，赋予了其在氧气匮乏的实体肿瘤坏死区域定植的能力[9]。此外，梭菌芽孢的萌发是由多种因素导致的，包括营养物质、酶、液体静压力或阳离子表面活性剂等[10]，使其形成具有代谢活性的细菌细胞。

目前已有多株梭状芽孢杆菌被报道应用于治疗肿瘤，包括溶组织梭状芽胞杆菌(C.histolyticum)[11]、破伤风梭菌(C.tetani)[12]、溶瘤梭菌(C.sporogenes)[13]和丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)[14]等。梭状芽孢杆菌在肿瘤治疗中的应用历史可以追溯到年，外科医生Vautier首先观察到肿瘤患者在感染梭状芽孢杆菌后患上气性坏疽，但患者体内的肿瘤竟然消退了[15]。年，Connell[1]首次使用来自溶组织梭状芽胞杆菌的细菌培养液干预治疗了30例癌症患者，结果发现肿瘤病情在部分患者上有所缓解。年，Parker等[16]首次将溶组织梭状芽胞杆菌用于治疗荷瘤小鼠，结果显示静脉注射细菌激发小鼠全身性免疫反应能在短期内延长小鼠寿命，但肿瘤并没有完全消退。年，Malmgren和Flanigan[17]通过探究破伤风梭菌在小鼠各个组织器官和瘤内的定植数量，进一步证明了梭状芽孢杆菌对实体瘤的特异定植能力。在对小鼠注射高浓度剂量的破伤风梭菌孢子的48h内，只有在实体瘤内检测到了破伤风梭菌，这说明了细菌孢子在实体瘤内定植的特异性。以上研究均表明，梭状芽孢杆菌具备肿瘤治疗的潜力。

但由于梭状芽孢杆菌的天然毒力过强，其在肿瘤治疗中的应用也受到一定限制。对此，Dang等[18]对包含双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)和梭状芽孢杆菌在内的26种不同菌株评估了其在实体瘤厌氧区的特异定植能力。通过将细菌或梭菌孢子静脉注射入B16黑色素瘤荷瘤小鼠后，发现一株诺维氏梭菌(C.novyi)表现出优异的定植能力。Dang等[18]通过对该菌株加热诱导，在多个细菌菌落中筛选到缺失致死性毒素基因的减毒株C.novyi-NT，从而降低了梭状芽孢杆菌在静脉注射后造成的全身毒性。减毒株C.novyi-NT的孢子仅在小鼠实体瘤的血管匮乏区域(厌氧区)出芽萌发，并破坏周围的肿瘤细胞。另外，Dang等[18]还开发了一种联合溶菌疗法(CombinationBacteriolyticTherapy，COBALT)，通过将C.novyi-NT孢子与常规化疗药物联合使用，显著延长了抗肿瘤作用的持续时间。这种细菌联合其他疗法的治疗策略不仅突破了常规化疗药物无法深入递送到血管匮乏的实体瘤内部的瓶颈，也开创了联合细菌治疗肿瘤的先河。

虽然目前对梭状芽孢杆菌治疗肿瘤的机制尚未清晰，但有研究表明梭菌产生的诸如胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶以及磷脂酶、溶血素和脂肪酶等破坏肿瘤细胞的毒素可能在肿瘤治疗中发挥了积极作用[19]。另外，也有研究报道梭菌孢子可以在肿瘤细胞中萌发，诱导表达针对在肿瘤发展中起关键作用的转录因子——缺氧诱导因子-1(HIF-1)[20]和不同细胞因子如TNF-α[21]、IL-2[22]和IL-12[23]，从而抑制肿瘤细胞的增殖或转移[18]。

值得